Электронная библиотека Веда
Цели библиотеки
Скачать бесплатно
Доставка литературы
Доставка диссертаций
Размещение литературы
Контактные данные
Я ищу:
Библиотечный каталог российских и украинских диссертаций

Вы находитесь:
Диссертационные работы России
Биологические науки
Физиология и биохимия растений

Диссертационная работа:

Яруллина Любовь Георгиевна. Механизмы индуцирования устойчивости пшеницы к грибным патогенам : дис. ... д-ра биол. наук : 03.00.12 Уфа, 2006 277 с. РГБ ОД, 71:07-3/87

смотреть содержание
смотреть введение
Содержание к работе:

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6

ВВЕДЕНИЕ 8

Глава I. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О МЕХАНИЗМАХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПАТОГЕНОВ И РАСТЕНИЙ (ОБЗОР Л ИТЕРАТУ РЫ) 16

1.1.1 Ірирода устойчивости растений к фитопатогенам 16

1.2. Активные формы кислорода и их функции при патогенезе 22

1.3. Защитная роль лигнина при инфицировании патогенными микроорганизмами 30

1.4. Синтез PR-белков - универсальная защитная реакция растений 37

1.5. Индуцирование естественных механизмов устойчивости растений .42

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 47

2.1. Объекты исследований 47

2.1.1. Инфицирование растений пшеницы грибными патогенами с различным типом питания 48

2.1.2. Препараты, используемые для обработки растений 49

2.1.3. Фиксация растительного материала 50

2.2. Методы исследований 50

2.2.1. Выделение оксалатоксидазы различной локализации в клетке и определение ее активности 50

2.2.2. Получение экстрактов свободной и связанной с клеточными стенками пероксидазы 51

2.2.3. Определение активности пероксидазы 51

2.2.4. Электрофоретическое разделение белков 52

2.2.5. Оценка активности фенилаланинаммиак-лиазы (ФАЛ) и тирозинаммиак-лиазы (ТАЛ) 53

2.2.6. Определение содержания белка 53

2.2.7. Хемилюминесцентное определение содержания перекиси водорода (Н2О2) в среде инкубации проростков пшеницы 54

2.2.8. Использование 3,3-диаминабензидина для выявления генерации Н202 в растительных тканях 54

2.2.9. Определение активности окисления фенольных соединений проростками пшеницы 55

2.2.10. Определение содержания лигнина в растительных гканях 56

2.2.11. Экстракция фитогормонов и количесвенный анализ ИУК, АБК и цитокининов в растительном материале 56

2.2.12. Определение активности протеиназ и их белковых ингибиторов58

2.2.12.1. Определение активности протеиназ, расщепляющих субстрат Ы-а-бензоил-ОЬ-аргинин-4-нитроанилид(БАПНА) 59

2.2.12.2. Определение активности ингибиторов протеиназ 59

2.2.13. Выделение ДНК из растений 60

2.2.14. Получение очищенной РНК из растительного материала 61

2.2.15. Подготовка праймеров для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) 62

2.2.16. Полимеразная цепная реакция 62

2.2.17. Реакция обратной транскрипции РНК 63

2.2.18. Электрофорез продуктов амплификации ДНК и РНК в агарозных и полиакриламидных гелях 63

2.2.19. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 64

2.2.20. Статистическая обработка результатов 64

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ...65

3.1. Генерация сигнальных молекул - начальный этап формирования защитного ответа растений при грибной инфекции 65

3.1.1. Участие внеклеточных окислительных ферментов в генерации сигнальных молекул 66

Регуляция процессов образования перекиси водорода (Н2О2) на ранних стадиях патогенеза 71

3.1.2. Усиление окисления фенолов - неспецифическая реакция растений на стресс 79

3.1.3. Оксалатоксидаза - один из ключевых ферментов в формировании защитных реакций растений к грибным патогенам 89

3.1.4. Регуляции защитного ответа растений элиситорами 106

3.2. Процессы лигнификации в тканях растений при инфицировании пшеницы грибными патогенами 116

3.2.1. Активность ферментов фенольного обмена, накопление лигнина в растениях пшеницы при патогенезе 116

3.2.2. Интенсификация процессов синтеза лигнина в растениях 128

3.3. Роль гормонов в становлении взаимоотношений растение - патоген 133

3.3.1. Гормональный статус растений пшеницы различной устойчивости при заражении грибными патогенами 136

3.3.1.1. Корневая гниль {Bipolaris sorokiniana) 136

3.3.1.2. Твердая головня (Tilletia caries) 142

3.3.1.3. Септориоз {Septoria nodorum) 144

3.3.2. Влияние росторегулирующих препаратов на содержание гормонов в растения пшеницы при инфицировании 152

3.4. Иніибиторьі протеолитических ферментов как компоненты защитной системы растений 155

3.4.1. Протеолитические ферменты патогенных грибов и их роль при патогенезе 155

3.4.2. Активность протеиназ и их ингибиторов в тканях устойчивых и восприимчивых сортов пшеницы при грибном патогенезе 159

3.4.3. Влияние индукторов устойчивости на активность ингибиторов протеиназ в растениях пшеницы 177

3.5. Изучение механизмов защитного действия индукторов устойчивости в культуре in vitro 180

3.5.1. Индукция защитного ответа в клетках пшеницы под воздействием хитоолигосахаридов 181

3.5.2. Индукция защитных реакций в каллусах пшеницы под воздействием салициловой кислоты 185

3.5.3. Влияние фунгицидов и иммуностимуляторов на формирование защитного ответа каллусов пшеницы к Т. caries 189

3.5.4. Изменение устойчивости каллусов пшеницы к Т. caries при ингибировании активности оксалатоксидазы 195

3.5.5. Влияние экзогенной перекиси водорода на защитные реакции куллусов пшеницы 200

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 205

ВЫВОДЫ 209

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 211 

Введение к работе:

Инфекционные болезни растений наносят значительный ущерб урожайности сельскохозяйственных культур. Потери урожая зерновых и зернобобовых культур от грибных болезней могут доходить до 30% [Тютерев, 2002]. Как известно, для защиты растений от болезней широко используются химические средства, подавляющие рост и развитие патогенных микроорганизмов. Однако интенсивное применение пестицидов биоцидной природы приводит, с одной стороны, к химическому загрязнению экосистем, и с другой - к появлению высокорезистентных к пестицидам форм патогенов. Одним из широко применяемых методов защиты растений от патогенов является создание и использование устойчивых к болезням сортов и линий сельскохозяйственных культур. Однако на практике оказывается, что гены устойчивости довольно быстро преодолеваются патогенами.

Наиболее перспективным и экологически безопасным способом защиты растений является использование препаратов, стимулирующих защитные механизмы растительного организма. В связи с этим, познание природы и механизмов формирования защитных реакций растений является актуальной задачей.

Устойчивость растений к различным инфекциям определяется комплексом физиолого-биохимических реакций, каждая из которых способствует защите от патогена [Метлицкий, 1976; Токин, 1980; Метлицкий и др., 1984; Метлицкий, Озерецковская, 1985; Курсанова, 1988; Ильинская и др., 1991; Озерецковская и др., 1993; Кораблева, Платонова, 1995; Тютерев, 2002; Тарчевский, 2002]. Одним из приоритетных направлений современной биологии является расшифровка сигналинга защитных реакций в растениях при инфицировании патогенами. В растительных тканях выявлен целый ряд сигнальных молекул, запускающих каскад ответных биохимических реакций в организме растений при контакте с патогеном. Такую роль могут выполнять фитогормоны, олигосахариды, жасмонат, салицилат, окись азота и некоторые другие соединения [Ильинская и др., 1991; Озерецковская и др., 1993; Кораблева, Платонова, 1995; Тютерев, 2002; Тарчевский, 2002]. Предполагается, что сигнальные молекулы не только участвуют в формировании первичных ответных реакций, но и определяют характер последующих биохимических и физиологических процессов, обуславливающих степень адаптации и устойчивости растений к действию патогенов [Дмитриев, 2003].

Одной из наиболее ранних ответных реакций растительного организма на внедрение патогена является локальная генерация активных форм кислорода (АФК) - окислиіельньїй взрыв, запускающий цепь последующих защитных реакций [Hippeli et al., 1999; Droge, 2002]. Так, в тканях растений при патогенезе резко повышается концентрация свободных радикалов (супероксидного 02 , гидроксильного ОН") и перекиси водорода (Н2О2). Несмотря на наличие многочисленных экспериментальных данных об участии АФК в индукции защитного ответа в растениях, источники и способы генерации этих соединений при патогенезе остаются малоизученными. Имеются сведения о том, что образование АФК в ходе окислительного взрыва катализируется оксислительно-восстановительными ферментами, локализованными на поверхности клеток [Bestwick. et al., 1997; Kawano, 2002; Blochina et al., 2003; Минибаева, 2005]. В частности, продукция Н202 в растительных тканях может активироваться ферментом оксалатоксидазой, способной окислять оксалаты с образованием Н2О2 [Dumas et al., 1995]. Изучение роли этой оксидазы при патогенезе представляется очень важным, так как щавелевая кислота является одним из факторов патогенности грибов [Berna, Bernier, 1999] и от возможности его утилизации растением во многом зависит исход противоборства хозяина и паразита. Известно, что перекись водорода участвует в запуске СВЧ-реакции, процессов лигнификации, а также может проявлять прямую антимикробную активность [Bolwell et al., 2002].

Аппарат воздействия на растение у фитопатогенов включает, по крайней мере, две группы разных веществ - токсины (гормоны) и гидролитические ферменты. Способность патогенных грибов секретировать в окружающую среду соединения, обладающие фитогормональной активностью [Angra et al, 1990; Кобыльский, 1990; Волынец и др., 1993], может приводить к нарушению гормонального статуса растительного организма и снижению эффективности протекания защитных реакций. Выявление характера и степени нарушения состояния гормональной системы инфицированного растения в зависимости от типа возбудителя болезни, несомненно, будет способствовать раскрытию разнообразия механизмов защиты.

К числу важнейших защитных биохимических процессов, проявляющихся как при механическом повреждении растительных тканей, так и в ходе развития ответных реакций на внедрение патогенов относится лигнификация [Stafford, 1988; Ильинская и др., 1991; Anterola, Lewis, 2002; Amthor, 2003]. Несмотря на многочисленные сведения о накоплении лигнина в растительных тканях при патогенезе, механизмы регуляции этого процесса пока не ясны. Можно полагать, что важную роль в регуляции этих процессов выполняют фитогормоны. Способность патогена к внедрению и развитию в растительном организме в значительной мере зависит также от активности внеклеточных гидролаз, в частности, протеолитических ферментов [Ибрагимов и др., 1995; Сапунова и др., 1997; Ryan, 2000; Валуева, Мосолов, 2004; Дунаевский и др., 2005.]. Предполагается, что взаимодействие протеолитических ферментов и ингибиторов в значительной мере определяет исход противоборства хозяина и патогена.

Таким образом, молекулярные механизмы развития устойчивости растений к грибным патогенам еще далеки от окончательной разгадки.

Деіальное изучение состояния гормональной системы, активности ферментов, участвующих в регуляции уровня продукции перекиси водорода, процессов лигнификации, образования защитных соединений в растениях при инфицировании грибными патогенами с различным типом питания, позволит, в конечном итоге, подойти к решению проблемы управления фитоиммунитетом.

Цель работы

Выявить механизмы, обеспечивающие формирование устойчивости растений пшеницы к возбудителям грибных болезней с различным типом питания.

Задачи исследований

1. Проанализировать характер изменения активности оксалатоксидазы в растениях пшеницы различной устойчивости при заражении грибными патогенами и сопоставить с уровнем продукции перекиси водорода.

2. Оценить значение гормональной системы в регуляции защитного ответа растений пшеницы при заражении возбудителями грибных болезней с различным типом питания.

3. Провести сравнительный анализ экспрессии гена анионной пероксидазы, активности фенилаланинаммиак-лиазы, тирозинаммиак-лиазы, и интенсивности накопления лигнина в различных по устойчивости сортах пшеницы при инфицировании грибными патогенами и обработке индукторами болезнеустойчивости.

4. Проанализировать характер изменения активности ингибиторов протеиназ в различающихся по устойчивости растениях пшеницы при инфицировании патогенными грибами.

5. Исследовать пути регуляции защитных реакций растений пшеницы индукторами устойчивости различной природы.

Положения, выносимые на защиту

В основе эффективного развития защитного ответа растений пшеницы на инфицирование грибными патогенами лежит перестройка в гормональной системе, связанная с повышением содержания цитокининов на фоне относительно стабильного баланса ИУК и АБК.

Генерация перекиси водорода, сопряженная с активацией оксалатоксидазы, является начальным этапом формирования защитного ответа растений пшеницы на инфицирование грибными патогенами. Определяющее значение в развитии защитных реакций выполняет связанная с клеточной стенкой форма фермента. Активность оксалатоксидазы находится под контролем гормональной системы растения, а также может регулироваться хитоолигосахаридами, салициловой кислотой и химическими индукторами устойчивости с рострегулирующими свойствами.

Признаком устойчивых форм пшеницы является высокий постинфекционный уровень накопления лигнина, обусловленный ранней и значительной активацией ферментов фенилаланинаммиак-лиазы и тирозинаммиак-лиазы, а также усилением экспрессии гена анионной пероксидазы и повышением ее активности.

Важный вклад в реализацию устойчивости пшеницы вносят белки-ингибиторы, подавляющие индуцируемую патогенами активность протеолитических ферментов. В тканях устойчивых форм пшеницы подавление активности ферментов протекает более эффективно за счет высокого содержания в растениях свободных ингибиторов.

Научная новизна

Выявлена интегральная роль цитокининов в формировании защитного отвеїа растений пшеницы к грибным патогенам с различным типом питания (некротрофы, биотрофы, гемибиотрофы).

Обнаружено, что значительный вклад в продукцию перекиси водорода в растительных тканях при инфицировании грибными патогенами вносит оксалаюксидаза, связанная с клеточной стенкой.

Впервые показано, что защитный механизм химических и природных индукторов устойчивости растений связан с их участием в генерации перекиси водорода на ранних этапах патогенеза. Выявлены пути регуляции защитного ответа растений хитоолигосахаридами и салициловой кислотой, которые, наряду с активацией оксалатоксидазы, индуцируют экспрессию гена анионной пероксидазы, что приводит к усилению синтеза лигнина в непосредственной близости от инфекционных структур патогена.

Получены данные о способности химических индукторов устойчивости усиливать активность свободных белковых ингибиторов в тканях вегетирующих растений пшеницы и таким образом повышать ее устойчивость к инфицированию грибными патогенами.

Выявлена защитная функция окисления фенолов растениями пшеницы с участием оксалатоксидазы и пероксидазы при инфицировании грибными патогенами с различным типом питания. Одним из механизмов подавления защитного ответа растений при грибном патогенезе является ингибирование активности пероксидазы в данной реакции под воздействием ИУК.

Практическая значимость работы

Разработан метод выявления внеклеточной генерации перекиси водорода с участием оксалатоксидазы, при котором активность окисления фенольного субстрата ортофенилендиамина может быть использована для оценки степени устойчивости растений пшеницы к грибным патогенам.

Обобщенные экспериментальные данные могут быть использованы для решения исследовательских задач фундаментального и прикладного характера, в том числе, направленных на повышение устойчивости растений пшеницы к широкому кругу фитопатогенных грибов и создание экологически безопасных иммуностимуляторов нового поколения.

Выявленная способность различных соединений стимулировать образование перекиси водорода в культуре in vitro может быть использована для быстрого и эффективного скрининга новых средств защиты растений.

Апробация работы

Основные результаты работы докладывались на Всероссийских съездах общества физиологов растений (С.-Петербург, 1993; Москва, 1999; Пенза, 2003), общества биохимиков (Москва, 1997, 2004; С.-Петербург, 2002), общества генетиков и селекционеров (Москва, 1994, 2004; С.-Петербург, 2000), по защите и иммунитету растений (С.-Петербург -Пушкин, 1995, 2002, 2005), конференциях «Физиолого-биохимические основы иммунитета растений к грибным болезням» (Уфа, 1988), «Регуляторы роста и развития растений» (Москва, 1993, 1999, 2001), «Иммуноанализ регуляторов роста» (Уфа, 1992, 2000), «Биология клетки в культуре» (С.-Петербург, 1998, 2000), «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 2004), на международных конгрессах и симпозиумах FESSP (Varna, 1998; Budapesht, 2000; Krit, 2002; Krakow, 2004), «Молекулярная и клеточная биология на рубеже веков» (Алматы, 1999), «Микология и криптогамная ботаника в России» (С.-Петербург, 2000), «Нетрадиционное растениеводство, экология и здоровье» (Алушта, 1998), «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Москва, 2001; С.-Петербург, 2003; Казань, 2006), «Plant Growth Substances» (Brno, 2001), «Геном растений» (Одесса, 2003), «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 1999, 2003; Москва, 2005), «Molecular Plant - Microbe Interactions» (С.-Петербург, 2003), «Регуляция роста и продуктивности растений» (Минск, 2005), «Signaling systems of Plant cell» (Москва, 2001; Казань, 2006), «Факторы экспериментальной эволюции организмов» (Алушта, 2006).

Связь с планами НИР

Работа выполнялась в соответствии с планами НИР Института биохимии и генетики УНЦ РАН по темам «Устойчивость пшеницы к ірибньїм заболеваниям и пути ее повышения» (№ гос. регистрации 01.92.018387), «Молекулярные механизмы развития ранних защитных реакций растительных клегок при повреждении фитопатогенными грибами» (№ гос. регистрации 01.99.008298), «Эндогенная регуляция сигнальных молекул при грибных инфекциях растений» (№ гос. регистрации 01.2002.05309).

Конкурсная поддержка работы

Исследования были поддержаны грантами РФФИ (№ 01-04-48495) «Хитин-специфичные пероксидазы как регуляторы интенсивности элиситорных сигналов при грибном патогенезе» и (№ 05-04-48310) «Сигнальная регуляция устойчивости пшеницы к стрессовым факторам различной природы».

Публикации

Основные результаты исследований отражены в 53 научных публикациях, в том числе 26 статей в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации результатов докторских диссертаций, 2 статьи в зарубежной печати.

Структура и объем диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка используемой литературы (637 работ, в том числе 404 на иностранных языках). Диссертация изложена на 277 стр., содержит 42 таблицы и 45 рисунков.

Личное участие автора в получении научных результатов. Личный вклад соискателя заключается в разработке идеи работы, в постановке и проведении экспериментов, в статистической обработке и интерпретации полученных результатов.

Подобные работы
Даминова Аниса Илдаровна
Физиолого-биохимические механизмы увеличения устойчивости и урожайности яровой пшеницы при некорневой обработке микроудобрением ЖУСС-2
Максимов Игорь Владимирович
Оксидоредуктазы и фитогормоны в регуляции устойчивости пшеницы к фитопатогенным грибам
Олениченко Наталья Александровна
Фенольные соединения и устойчивость мягкой пшеницы (Triticum Aestivum L.) к низкотемпературному воздействию
Бурханова Гузель Фанилевна
Анионные пероксидазы как компонент устойчивости растений пшеницы к фитопатогенным грибам
Трошина Наталия Борисовна
Перекись водорода как регулятор устойчивости растений и каллусов пшеницы к грибным патогенам
Бормотова Татьяна Сергеевна
Физиолого-биохимическая характеристика аллоцитоплазматических гибридов пшеницы в связи с их устойчивостью к засухе
Кильдибекова Алсу Ринатовна
Механизмы защитного действия агглютинина зародыша пшеницы на ростовые процессы растений пшеницы
Авганова Холиса Хокироевна
Изучение физиолого-биохимических механизмов устойчивости растений картофеля к высокой температуре с использованием клеточной технологии
Волуевич Елена Александровна
Генетические основы устойчивости пшеницы к возбудителю бурой ржавчины Puccinia triticina Erikss. в условиях БССР
Шматко Сергей Викторович
Экологические аспекты повышения устойчивости озимой пшеницы к корневым гнилям и септориозу на черноземе выщелоченном и южном

© Научная электронная библиотека «Веда», 2003-2013.
info@lib.ua-ru.net