Электронная библиотека Веда
Цели библиотеки
Скачать бесплатно
Доставка литературы
Доставка диссертаций
Размещение литературы
Контактные данные
Я ищу:
Библиотечный каталог российских и украинских диссертаций

Вы находитесь:
Диссертационные работы России
Биологические науки
Экология

Диссертационная работа:

Галицкая Полина Юрьевна. Микробный контактный тест на основе Bacillus pumilus для оценки токсичности загрязненных почв и отходов : дис. ... канд. биол. наук : 03.00.16 Казань, 2006 166 с. РГБ ОД, 61:07-3/132

смотреть содержание
смотреть введение
Содержание к работе:

Введение 4
Глава 1 Обзор литературы. Оценка токсичности индивидуальных веществ, состояния

почв и плотных антропо-генных образований с использованием микроорганизмов. 10
Общие положения

1.1 Методы биотестирования 10

1.1.1 Биотестирование с использованием микроорганизмов 13

1.1.1.1 Угнетение роста микробной культуры 13

1 1.1.2 Ферментные тесты 14
1.1.1.3 Тесты, основанные на ингибировании люминесценции 16

1.1.1 Биотестирование с использованием других организмов 21

1.2 Методы, основанные на оценке состояния аборигенной микрофлоры 24

  1. Определение состояния почв и плотных антропогенных образований на основе измерения микробной биомассы

  2. Оценка состояния объектов на основе анализа процессов трансформации азота и углерода в почве

  3. Оценка состояния почв на основании измерения ферментативной _„ активности аборигенной микрофлоры

  4. Оценка состояния экосистем на основе определения микробного - . разнообразия и устойчивости сообществ

1.3 Влияние металлов на микроорганизмы 40
Глава 2 Материалы и методы исследования 44

2.1 Объекты исследования, культивирование, идентификация 44

  1. Объекты исследования 44

  2. Культивирование организмов 44

  3. Идентификация организмов 44

2.1.3.1 Экстрагирование ДНК 44

2 1.3.2 Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) 45
2.1.3.3 Секвенирование продукта ПЦР 46

2.2 Методы биотестирования 47

2.2.1 Биотестирование объектов с использованием Bacillus pumilus КМ-21 47

  1. Контактное биотестирование 47

  2. Биотестирование водных образцов 48 2 2.1.3 Элюатное биотестирование 49

  1. Определение дегидрогеназной активности аборигенной .„ микрофлоры почвенных образцов

  2. Биотестирование объектов с использованием Paramecium caudatum 49

  3. Биотестирование объектов с использованием Ceriodaphma affinis 51

2.3 Анализируемые образцы 52

2.3.1 Водные растворы 52

2 3.2 Искусственно загрязненные почвенные образцы 52

  1. Незагрязненные почвы с различным содержанием органического .-вещества

  2. Почвы, обработанные компостом 53

  3. Модельные образцы отходов 53

  4. Промышленные отходы 54

2.4 Обработка и оценка результатов 55
Глава 3 Результаты и обсуждение 57

3.1 Выбор тест-объекта 57

  1. Ростовые характеристики бактерий рода Bacillus 5 7

  2. Дегидрогеназная активность бактерий рода Bacillus 59

  3. Чувствительность бактерий рода Bacillus к стандартным токсикантам

  1. Идентификация тест-объекта 63

  2. Определение опрерационных параметров и стандартизация методики контактного биотестирования

3.3.1 Определение операционных параметров методики 68

3 3.2 Стандартизация условий биотестирования 70

3 3.3 Определение поправочного коэффициента при тестировании 7]

почвенных образцов

  1. Определение метрологических характеристик методики контактного 7. биотестирования

  2. Определение концентраций стандартных токсикантов, вызывающих 50%-ный 7Q ингибирующий эффект

  1. Определение концентраций стандартных токсикантов, вызывающих 7„ 50%-ный ингибирующий эффект, с помощью линейной модели

  2. Определение концентраций стандартных токсикантов, вызывающих „„ 50%-ный ингибирующий эффект, с помощью нелинейных методов

3.6 Анализ токсичности почвенных образцов, содержащих индивидуальные
металлы, их смесь и органический токсикант, методами контактного и элюатного 90
биотестирования

  1. Анализ токсичности поченных образцов методами контактного и элюатного д~ биотестирования

  2. Определение токсичности почвенных образцов на основе оценки д„ активности аборигенной микрофлоры

  1. Анализ токсичности почвенных образцов, загрязненных хромом и кадмием, в „ тестах с использованием Р caudatum и С affims

  2. Использование методики контактного биотестирования для оценки класса . „, опасности промышленных отходов и почв

  1. Определение токсичности промышленных отходов 106

  2. Создание ранжировочной таблицы для отнесения отходов к классам ... опасности

  3. Определение классов опасности отходов на основании результатов .. ~ биотестирования с использованием В pumilus, Р caudatum и С affims

Выводы 117

Список литературы 119

Приложение 1 Хроматограмма нуклеотидных последовательностей, полученных с помощью

праймеров 616V, 609R, MR rev, 699R

Приложение 2 Нуклеотидные последовательности штаммов В pumilus КМ-21 и Bacilllus spp.,

содержащихся в базе данных базы данных

Приложение 3 Результаты определения ЕС50 и соответствующих им доверительных

интервалов с помощью нелинейных математических моделей для водных растворов и

почвенных образцов, загрязненных Сс1(ЫОз)г*4Н20 и К2СГ2О7

Приложение 4 Справка об использовании результатов диссертационной работы Галицкой

П Ю. в Центральной специализированной инспекции аналитического контроля при МЭПР

Приложение 5 Справка об использовании результатов диссертационной работы Галицкой

П.Ю. в ЦЗЛ ОАО «КЗСК»

Введение к работе:

Актуальность работы. Растущая антропогенная нагрузка на экосистемы диктует необходимость разработки системы мер по ее минимизации. Для эффективного природоохранного управления необходима информация о степени опасности загрязняющих веществ для окружающей среды, прежде всего, их токсичности (Filip, 2002; Ладонин, Пляскина, 2004; Feisthauer et al., 2005; Fernandez et al., 2005; Classens et al., 2006; Судницын, 2006). В настоящее время наряду с методами химического анализа для оценки состояния природных и антропогенных объектов все чаще используются биологические методы. Наиболее сложны для анализа плотные многокомпонентные объекты, такие как почва, бытовые и промышленные отходы (Латыпова с соавт., 2002; Malkomes, 2006).

Одно из перспективных направлений в оценке плотных многокомпонентных сред -микробные тесты (Abbondanzi et al, 2003; Kookana et al, 2004; Van Beelen, 2003; Hinojosa et al., 2004; Rajapaksha, 2004). Наиболее разработаны методы, основанные на оценке аборигенной микрофлоры, которые являются достаточно простыми и чувствительными к токсикантам (Хазиев, 2005; Moreno et al., 2006; Sauve, 2006; Palmroth et al. 2006). Однако при интерпретации результатов зачастую возникают проблемы, связанные с отсутствием незагрязненного образца, идентичного анализируемому. Альтернативой указанным методам являются методы биотестирования, основанные на оценке ответной реакции интродуцированной микрофлоры (Ronnpagel et al., 1998; Athiainen et al., 2002). В настоящее время разработано большое количество таких тестов, включая ряд коммерческих, однако в основном они предназначены для оценки токсичности водных образцов (Карапеп, Itavaara, 2001; Селивановская, 2004; Classens et al., 2006). В случае же тестирования плотных образцов обязательная процедура - это получение водного экстракта (ISO 10712: 1995 (Е), 1995; ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.3-99, 1999; ФР.1.39.2003.00923, 2003; Plaza, 2005; Fjallborg, 2006). Однако результаты, полученные на водных экстрактах, могут недоучитывать тип и количество загрязняющих веществ (Roenpagel et al., 1998; Alonso, 2006). Кроме того, общая проблема методов биотестирования - это отсутствие адекватного подхода к математическому описанию результатов экспериментов.

Минимизировать недостатки обоих подходов может использование методов
контактного биотестирования. В настоящее время такие методы разработаны в
основном для высших растений и животных (Feisthauer, 2005; Moreno, 2006), тогда как
методы с использованием микроорганизмов - основных агентов круговоротов
элементов - в России отсутствуют, а в Европейском Союзе и США находятся в стадии
разработки. Перспективным, на наш взгляд, в качестве тест-объекта использовать
микроорганизмы, относящиеся к роду Bacillus, которые являются типичными
представителями микрофлоры плотных сред, в частности, почв, а в качестве тестовой
функции рассматривать активность фермента дегидрогеназы, отражающего общую
метаболическую активность клеток.

Соруководитель работы в области математического моделирования - д.б.н., к.ф.-м.н., профессор Савельев А.А.

Цель данной работы - разработка метода контактного микробного биотестирования для оценки токсичности многокомпонентных плотных объектов. Задачи исследования.

  1. Выбрать в качестве тест-объекта штамм, обладающий максимальной дегидрогеназной активностью и высокой чувствительностью к токсикантам, и осуществить его видовую идентификацию с использованием методов молекулярной биологии на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рДНК.

  2. Разработать методику контактного биотестирования и определить метрологические параметры методики - прецизионность, повторяемость и интервалы концентраций стандартных токсикантов (Сг+6, Cd+2), вызывающих 50% ингибирование тест-функции (ЕС50), в водных и почвенных образцах.

  3. Определить адекватную математическую модель, описывающую результаты анализа водных и почвенных образцов различными методами биотестирования и методом оценки аборигенной микрофлоры.

  4. Определить токсичность модельных почвенных образцов, загрязненных металлами, их смесью и органическим токсикантом, методом оценки активности аборигенной микрофлоры, методом контактного биотестирования с использованием Bacillus pumilus, методами элюатного биотестирования с использованием В. pumilus, инфузории Paramecium caudatum и ветвистоусого рачка Ceriodaphnia affinis и оценить чувствительность методов анализа.

  5. Разработать ранжировочную систему для отнесения промышленных и бытовых отходов к классам опасности и установить токсичность образцов промышленных отходов для В. pumilus, P. caudatum и С. affinis.

Научная новизна.

Впервые предложена методика контактного биотестирования с использованием дегидрогеназной активности бактерии В. pumilus КМ-21 для оценки опасности плотных объектов (почв и отходов). Стандартизированы условия культивирования тест-объекта, подготовки его к тестированию и операционные параметры реакции. Определены метрологические характеристики методики биотестирования - прецизионность, повторяемость и диапазон концентраций стандартных токсикантов (Cr+ , Cd+), вызывающих 50%-ный ответный отклик тестового параметра (ЕС5о)-

Впервые проведен сравнительный анализ пяти математических моделей зависимости «концентрация токсиканта - эффект» и показано, что наиболее адекватно описывает реальные результаты кинетическая модель неполного ингибирования.

Впервые на основе изучения различных способов определения токсичности почвенных образцов, искусственно загрязненных индивидуальными металлами, их смесью и органическим токсикантом, установлено, что разработанная методика контактного биотестирования с использованием В. pumilus КМ-21 по чувствительности сопоставима с тестированием на основе аборигенной микрофлоры и превосходит метод элюатного биотестирования с использованием В. pumilus КМ-21. Результаты

контактного теста более тесно коррелируют с результатами теста с аборигенной микрофлорой по сравнению с элюатным тестом.

Впервые с использованием разработанной методики определены границы токсичности отходов, позволяющие ранжировать их по классам опасности. Продемонстрировано, что контактный тест с использованием В. pumilus КМ-21 дает возможность выявить большее количество отходов, относящихся к 2 и 3 классам опасности по сравнению с используемыми в настоящее время элюатными тестами на основе низших ракообразных С. afflnis и простейших P. caudatum.

Практическое значение работы. По результатам проведенных исследований разработана, стандартизирована и подготовлена к аттестации в органах Госстандарта методика определения токсичности плотных объектов с использованием бактерии В. pumilus КМ-21. Предлагаемая методика опробована для определения токсичности реальных образцов промышленных отходов, образующихся на предприятиях РТ. Методика передана на апробацию в Центральную специализированную инспекцию аналитического контроля при МЭПР РТ и в Центральную заводскую лабораторию ОАО «КЗСК». Результаты исследований используются при проведении практических работ по курсам «Экологическое нормирование» и «Управление в обращении с отходами» на кафедре прикладной экологии Казанского государственного университета (КГУ), а таюке включены в учебное пособие «Теория и методы экологического нормирования» (2006), рекомендованное для обучения студентов и аспирантов экологического факультета КГУ.

Результаты, полученные в исследованиях, могут быть использованы для совершенствования системы почвенного мониторинга и при разработке мер по минимизации негативного влияния промышленных отходов на окружающую среду.

На защиту выносятся следующие положения:

Разработанная методика контактного биотестирования плотных объектов (почв и отходов) с использованием дегидрогеназной активности бактерии В. pumilus КМ-21 является более чувствительной в отношении ряда металлов, их смеси и органического токсиканта по сравнению с элюатной методикой с использованием того же тест-объекта и сопоставима по чувствительности с методикой на основе тестирования аборигенной микрофлоры.

Установленные метрологические характеристики методики биотестирования (презиционность и диапазон ЕС5о стандартных токсикантов), а таюке стандартные условия ее проведения позволяют рекомендовать методику для использования в различных лабораториях и получать сравнимые результаты.

Для всех трех вариантов тестирования (контактное, элюатное биотестирование и оценка активности аборигенной микрофлоры) зависимость «концентрация токсиканта -вызываемый эффект» наиболее адекватно описывается кинетической моделью неполного ингибирования.

Предложенный способ создания «суррогатного» контрольного образца дает возможность оценить степень негативного воздействия токсикантов в природных образцах и отходах при отсутствии идентичных незагрязненных образцов.

Установленные границы токсичности, определяемые с использованием предлагаемой методики, позволяют ранжировать отходы по классам опасности для биологических объектов окружающей среды.

Апробация работы. Материалы работы изложены на II Международной научно-практической конференции «Экология: образование, наука, промышленность и здоровье» (Белгород, 2004), VI республиканской конференции «Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан» (Казань, 2004), Международных молодежных конференциях «Туполевские чтения» (Казань, 2004, 2005), Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы аграрной науки и пути их решения» (Ижевск, 2005), Всероссийской научной конференции «Современные аспекты экологии и экологического образования» (Казань, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ.

Личный вклад автора в работу состоит в выполнении экспериментальной части диссертации, обсуждении результатов и формулировании выводов на их основе. Соавторами публикаций являются научный руководитель д.б.н. Селивановская С.Ю., д.х.н., профессор, заведующий кафедрой прикладной экологии Латыпова В.З., сотрудники Гиссенского Университета (ФРГ) профессора Hummel Н., Duering R-A. и Gaeth S., сотрудник Кливлендского университета (Огайо, США) профессор Hung Y-T., участвовавшие в обсуждении результатов. В создании программы для математической обработки результатов принимали участие д.б.н., профессор Савельев А.А. и к.х.н., с.н.с. Семанов Д.А.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 151 странице; состоит из обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела собственных исследований и обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 34 рисунка, 15 таблиц. Список литературы содержит 47 отечественных и 249 зарубежных источников.

Подобные работы
Черный Евгений Сергеевич
Агроэкологическая эффективность применения цеолитовых туфов и отходов производства под ячмень на светло-серых лесных почвах северной лесостепи Центрально-Черноземного региона РФ
Григорьевская Ирина Ивановна
Антительные тест-системы на основе полимерных суспензий для мониторинга биополлютантов и биологически важных соединений
Горбачева Елена Анатольевна
Оценка токсичности донных отложений морских акваторий, подверженных антропогенному воздействию (На примере Баренцева и Белого морей)
Тарасенко Екатерина Михайловна
Биологическая активность и токсичность почв при нефтяном загрязнении и рекультивации
Подосельников Игорь Юрьевич
Использование природных водорослевых сообществ водоемов и почв Сургутского района в качестве тест-систем для определения токсичности буровых шламов и химических реагентов
Каллистова Анна Юрьевна
Аэробное окисление метана в покрывающей почве полигона твердых бытовых отходов
Кубашев Сергей Казиуллович
Изменение структурно-минералогической основы, состава и свойств слитых почв при воздействии на них веществ различной природы (промышленные отходы, стандартные удобрения, мелиоранты) в условиях Центрального Предкавказья
Вершняк Татьяна Викторовна
Условно-патогенная микрофлора в птицехозяйствах и диагностика эшерихиоза птиц на основе тест-системы иммуноферментного анализа
Романенко Михаил Николаевич
Разработка и совершенствование тест-систем на основе молекулярно-биологических методов для диагностики некробактериоза
Глотов Андрей Сергеевич
Разработка и апробация тест-систем на основе гелевых биочипов для изучения генетического полиморфизма человека

© Научная электронная библиотека «Веда», 2003-2013.
info@lib.ua-ru.net